Разделы

Справочная информация

Методика постановки непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции

400 - 500 тысяч клеток, выделенных в градиенте фиколл-верографин (выпускается НПЦ МедБиоСпектр), инкубировать в пробирке с 20 мкл рабочего раствора МКАТ в течение 30 мин при комнатной температуре.
Kлетки отмыть один раз 1 мл буфера PBS или, для снижения фонового окрашивания клеток, буферным раствором для постановки реакций (выпускается НПЦ МедБиоСпектр), осадить центрифугированием при 1000-1200 об/мин. 
Супернатант тщательно удалить, а клеточный осадок суспендировать в 20 мкл рабочего раствора FITC-конъюгатов вторичных антител (FITC-анти-мышь выпускается НПЦ МедБиоСпектр) и инкубировать в течение 30 мин при 4оС. 
Kлетки дважды отмыть в 1.0 мл буферного раствора и суспендировать в 50 мкл. При наличии центрифужного ротора для микроплат, все реакции удобно проводить в круглодонном иммунологическом планшете. 

Клеточную суспензию поместить в лунку, вырезанную в полоске Parafilm'а, наклеенной на предметное стекло (на одном стекле можно вырезать 12-14 лунок для просмотра разных препаратов), или в лунки специальных предметных стекол (производятся НПЦ МедБиоСпектр). При отсутствии Parafilm'а на одно предметное стекло можно помещать в виде капли клетки из трех пробирок. Для более прочной сорбции клеток на стекле рекомендуется предварительно поместить в лунки по 20 мкл раствора поли-L-лизина (выпускается НПЦ МедБиоСпектр) и после 45 мин инкубации раствор удалить, а в лунку внести суспензию клеток из пробирки. 
Клетки инкубировать на стекле 20 мин, после чего из лунок осторожно отсосать буфеный раствор, и вместо него внести в лунки по 10 мкл 50% раствора глицерина. 

При учете результатов реакции на отечественных люминесцентных микроскопах предметные стекла не следует покрывать покровными стеклышками, а осторожно поместить объектив в лунку на стекле, используя 50% раствор глицерина в качестве иммерсионной среды. Рекомендуется использовать объектив микроскопа 90х и окуляр 7-10х. 
Учитываются светящиеся клетки (свечение в форме кольца). Результаты реакции следует учитывать в течение 24 час после постановки, предохраняя препараты от воздействия прямого интенсивного света. Микроскопирование производить в тщательно затемненном помещении. 

Иммунопероксидазное окрашивание клеток

При отсутствии люминесцентного микроскопа может быть использован вариант иммуноферментного окрашивания связанных с МКА клеток-мишеней. Для выполнения этой методики клетки выделить и инкубировать с МКА так же, как описано выше, заменив FITC-конъюгат вторичных антител на иммуноферентный конъюгат (анти-мышь - пероскидаза - выпускается НПЦ МедБиоСпектр). 

После 30 мн инкубации с пероксидазным конъюгатом при 4оС клетки дважды отмыть 1 мл буферного раствора, и суспендировать осадок в 20 мкл раствора хромогенного субстрата (из расчета: 3 мг 3,3-диаминобензидина растворить в 5.0 мл физраствора, добавить 15 мкл 3% р-ра перекиси водорода, профильтровать через бумагу. ВНИМАНИЕ! Раствор субстрата не хранится, поэтому должен готовиться перед использованием). 

После 10-15 мин инкубации с субстратом (при комнатной температуре под визуальным контролем развития окраски) клетки дважды отмыть 1 мл буферного раствора, суспендировать в 50 мкл и поместить в лунки на предметном стекле, как описано выше. 

Учитывать процент клеток с мембранным типом реакции (желто-бурое окрашивание) в световом микроскопе.